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本试剂盒提供了构建DNA文库需要的酶预混体系及反应缓冲液，包含除接头以外的所有成分，制备的文库可用于Ion torrent PGM、Ion Proton二代测序平台的测序。和常规建库方法相比，该试剂盒将多个步骤进行了合并，省略了多个纯化步骤，因此显著降低了起始模板DNA的最少需求量，缩短了文库构建时间。另外，试剂盒采用高保真DNA聚合酶进行文库富集，无偏好的PCR扩增，扩大了序列的覆盖区域，可高效的制备用于Ion torrent二代测序平台的DNA文库。

• 磁力架：建议使用Life公司磁力架。
  
• DNA纯化回收试剂盒：建议使用百奥莱博DNA纯化回收试剂盒(磁珠法)(货号：WE0205)。
  
• 样本接头引物试剂盒。
  
• 无水乙醇，EB(10mM Tris-HCl,pH8.0)，去离子水(pH在7.0～8.0之间)。
  
• 反应管：建议使用低吸附的PCR管与1.5mL离心管；枪头：建议使用高质量过滤枪头防止试剂盒、文库样本污染。

• 避免试剂盒中Buffer的反复冻融，建议首次使用时将Buffer进行分装保存。酶在使用完应尽快放回-20℃保存，
  
• PCR产物因操作不当极易产生污染，导致实验结果不准确，建议将PCR反应体系配制区与PCR产物纯化区隔离，并使用专门的移液器，定期对各实验区域进行清洁。

• 向200μL PCR管中加入以下成分，用枪头将上述溶液轻轻混匀，瞬时离心使所有组分收集到管底。
  

  成分	用量
  10×End Repair Buffer	6μL
  End Repair Enzyme Mix	2μL
  fragmented DNA	X(10ng～1μg)
  RNase-Free Water	Up to 60μL

  
  
• 将管子置入PCR仪中，热盖打开，反应程序如下：
  20min@25℃
  10min@70℃
  Hold on 4℃

• 向上述反应液中直接加入以下试剂，用枪头将上述试剂混匀，短暂离心，使溶液收集到管底。
  

  成分	用量
  Ligation and Nick Repair Buffer	10μL
  T4 DNA Ligase	2μL
  Bst DNA Polymerase	2μL
  Adaptor A	7μL
  Adaptor P1	7μL
  RNase-Free Water	12μL
  Total volume	40μL

  注：建议Adaptor的加入量与DNA片段的摩尔比为10:1-20:1，具体Adaptor的使用浓度请参照下表。如果DNA量为10～100ng,adaptor建议使用浓度为1μM（小于260bp）或0.5μM（300～400bp）。
  

  插入DNA量/反应	不同大小DNA建议Adaptor使用浓度
  	130bp	260bp	320bp	410bp
  1μg	10μM	10μM	5μM	5μM
  500ng	5μM	5μM	2.5μM	2.5μM
  100ng	1μM	1μM	0.5μM	0.5μM

• 反应步骤
  15min@25℃
  5min@65℃
  Hold on 4℃

• 涡旋振荡MagPure20秒，使其彻底混匀为均一溶液；
  
• 将100μL adaptor连接反应缓冲液转移至一新的1.5mL离心管中；
  
• 加入60μL混合均匀的MagPure，涡旋震荡5秒钟后室温静置5分钟；
  
• 短暂离心，将离心管置于磁力架上，使磁珠和上清溶液分离，直至溶液澄清（约需5分钟），小心地将上清溶液转移至新的1.5mL离心管中，并弃去磁珠；
  注意：不要弃除上清。
  
• 向上清中加入20μL混合均匀的MagPure，涡旋震荡5秒钟后室温放置5分钟；
  构建不同大小的DNA文库时，需进行DNA片段的选择性回收。若起始样本量低于50ng，不建议进行DNA片段选择性回收。可参考另一种方案，直接进行DNA片段的纯化。建议使用百奥莱博DNA纯化回收试剂盒(磁珠法)(货号：WE0205)进行DNA片段选择性回收。若使用除我司以外厂家的磁珠，需自行摸索最佳磁珠用量。以下操作步骤采用百奥莱博磁珠法DNA纯化回收试剂盒，可选择回收DNA片段长度范围为310～370bp（读长为200bp），反应起始体积为100μL。
  
• 短暂离心，将离心管放于磁力架上，使磁珠和上清溶液分离，直至溶液澄清（约需5分钟），小心移取上清并弃除，期间避免接触结合目标DNA的磁珠；
  注意：不要弃除磁珠。
  
• 继续保持离心管固定于磁力架上，向离心管中加入250μL新配置的80%乙醇，室温放置30秒，待悬起的磁珠完全吸附后，小心弃除上清；
  
• 重复步骤7；为彻底移除残留液体，可将离心管短暂离心后，再次移除残留液体。
  
• 保持离心管固定于磁力架上，室温静置5分钟，使磁珠在空气中干燥；
  
• 将离心管从磁力架上取下，加入25μL 10 mMTris-HCl（pH8.0）或去离子水（自备），涡旋振荡使磁珠完全重悬于洗脱液中，室温静置5分钟；
  
• 短暂离心，将离心管放于磁力架上直至溶液澄清（约需5分钟），将25μL洗脱液转移至一个新的PCR管中。

• 涡旋振荡MagPure20秒，使其彻底混匀为均一溶液。
  
• 将adaptor连接反应液转移至一新的1.5mL离心管中。
  
• 加入1倍样品体积的MagPure，涡旋震荡5秒钟后，室温静置5分钟。
  
• 短暂离心，将离心管放于磁力架上，使磁珠和上清溶液分离，直至溶液澄清（约需5分钟），小心吸取上清并弃除，期间避免接触已结合目标DNA的磁珠。
  注意：不要弃除磁珠。
  
• 继续保持离心管固定于磁力架上，向离心管中加入250μL新鲜配置的80%乙醇，室温放置30秒，待悬起的磁珠完全吸附后，小心弃除上清。
  
• 重复步骤5。为彻底移除残留液体，可将离心管短暂离心后，再次移除残留液体。
  
• 保持离心管固定于磁力架上，室温静置5分钟，使磁珠在空气中干燥。
  
• 将离心管从磁力架上取下，加入25μL EB（自备）或去离子水，涡旋振荡使磁珠完全重悬于洗脱液中，室温静置5分钟。
  
• 短暂离心，将离心管放于磁力架上直至溶液澄清（约需5分钟），将25μL洗脱液转移至一个新的PCR管中。

• 在PCR管中加入以下试剂并混匀
  

  成分	用量
  连接adaptor后的DNA片段	20μL
  2×HiFidelity PCR Mix	25μL
  10×Primer Mix (5μM each)	5μL
  总体积	50μL

• PCR反应条件
  

  步骤	温度	时间	循环数
  预变性	98℃	30s	1
  变性	98℃	10s	4～12
  退火	65℃	30s
  延伸	72℃	30s
  终延伸	72℃	5min	1

  注：样本量为1μg时，4～6个cycles，样本量100ng时6-8个cycles，样本量为10ng时10～12个cycles。PCR循环数可根据实验进行优化。

• 涡旋振荡MagPure 20秒，使其彻底混匀为均一溶液；
  
• 将PCR反应液转移至一新的1.5mL离心管中；
  
• 加入1倍样品体积的MagPure，涡旋震荡5秒钟后室温静置5分钟；
  
• 短暂离心，将离心管放于磁力架上，使磁珠和上清溶液分离，直至溶液澄清（约需5分钟）。小心移取上清并弃除，期间避免接触结合目标DNA的磁珠；
  注意：不要弃除磁珠
  
• 继续保持离心管固定于磁力架上，向离心管中加入250μL新鲜配置的80%乙醇，室温放置30秒，待悬起的磁珠完全吸附后，小心弃除上清。
  
• 重复步骤5；为彻底移除残留液体，可将离心管短暂离心后，再次移除残留液体。
  
• 保持离心管固定于磁力架上，室温静置5分钟，使磁珠在空气中干燥。
  
• 将离心管从磁力架上取下，加入25μL EB（自备）或去离子水，涡旋振荡使磁珠完全重悬于洗脱液中，室温静置5分钟，短暂离心，将离心管放于磁力架上直至溶液澄清（约需5分钟），将25μL洗脱液转移至一个新的PCR管中，DNA文库在-20℃保存。